Application of TRIS Buffer in Plasmid Extraction by Agarose Electrophoresis

Tris (Τριυδροξυμεθυλαμινομεθάνιο) είναι μια αδύναμη βάση με pKa 8,1 σε θερμοκρασία δωματίου 25°C και αποτελεσματικό εύρος ασφαλείας pH 7,0 ~ 9.2Το pH του υδατικού διαλύματος Tris αλκαλίας είναι περίπου 10.5Το υδροχλωρικό οξύ προστίθεται συνήθως για να προσαρμόζεται η τιμή pH στην επιθυμητή τιμή, έτσι ώστε να μπορεί να ληφθεί το απόθεμα ασφαλείας αυτής της τιμής pH.Το DNA θα αποπροτονιστεί σε ένα τέτοιο διάλυμα., βελτιώνοντας έτσι τη διαλυτότητά του. Εάν το οξύ διάλυμα που έχει ρυθμιστεί με βάση το pH αντικατασταθεί με οξικό οξύ, λαμβάνεται ένα "απόθεμα ασφαλείας TAE" (Tris/Acetate/EDTA),ενώ λαμβάνεται ένα "buffer TBE" (Tris/Borate/EDTA) αντικαθιστώντας το με βορικό οξύΤα δύο αυτά αναισθητικά χρησιμοποιούνται συνήθως σε πειράματα ηλεκτροφωρέσης νουκλεϊκών οξέων. Τα TAE, TBE κλπ. που παρασκευάζονται από την Tris είναι τα πιο συχνά χρησιμοποιούμενα αντιδραστήρια για ηλεκτροφωρέση DNA και TE (pH 8.0) χρησιμοποιείται κυρίως για την διάλυση του DNA.(ΤΕ είναι ένας συνδυασμός Tris και EDTA.) 1MTris-HCl6.8 και 1.5MTris-HCl8.8 είναι τα πιο συχνά χρησιμοποιούμενα αντιδραστήρια για το SDS-PAGE.

Αντιδραστήριο TRIS

Μεταξύ των συμβατικών εργασιών της γενετικής μηχανικής, η ηλεκτροφόρηση με τζελ αγαρόζης είναι η πιο ευρέως χρησιμοποιούμενη.προσδιορισμός και καθαρισμός θραυγμάτων DNAΧρησιμοποιεί συνήθως μια οριζόντια συσκευή ηλεκτροφόρησης για την ηλεκτροφόρηση κάτω από ένα ηλεκτρικό πεδίο με σταθερή ένταση και κατεύθυνση.Τα μόρια DNA φορτίζονται αρνητικά σε μπουφέρες ζελέ (συνήθως αλκαλικά) και μεταναστεύουν από αρνητικά σε θετικά ηλεκτρόδια σε ένα ηλεκτρικό πεδίοΟ ρυθμός μετανάστευσης των μορίων DNA εξαρτάται από το μέγεθος και τη διαμόρφωση του μορίου.κλπ..

Λειτουργίαδιαδικασία:

1 tampon TE: (10 mmol/L Tris-HCl, 1 mmol/L EDTA)

Τεχνική συσκευή για την ηλεκτροφόρηση (50XTAE)

2 Ταμείο ηλεκτροφόρησης (50XTAE): Tris 242g, παγετώδες οξικό οξύ 57, 1 ml, EDTA (0, 5 mol/ L pH 8, 0) 100 ml

Μετά τη χρήση αραιώνεται 50 φορές με απόσταγμα νερό.

3 Κωφίδα δείγματος (6X): 0,25% μπλε βρομοφαινόλης, 0,25% μπλε ξυλενίου, 40% (W/V) σακχαρόζη

4 tampon STET (pH 8,0) (8% σακχαρόζη, 0,5% τριτόν, 50 mmol/l EDTA, 10 mmol/l Tris)

1) Μετράμε 100 ml διαλύματος ηλεκτροφορέσης TAE, προσθέτουμε 0,7 g αγαρόζης, αναμιγνύουμε καλά, τοποθετούμε στον φούρνο μικροκυμάτων, θερμαίνουμε για 3 λεπτά, διαλύουμε πλήρως την αγαρόζη.

2) Κλείστε την καθαρή και στεγνή ηλεκτροφορετική πλάκα με αποστειρωμένο καουτσούκ και σφραγίστε την άκρη με μικρή ποσότητα διαλύματος αγαρόζης.Τοποθετήστε τη χτένα και ρυθμίστε την απόσταση μεταξύ της κάτω άκρης της χτένας και της πλάκας ηλεκτροφορέσης, γενικά 1-2 mm είναι κατάλληλα.

3) Όταν το διαλυμένο διάλυμα αγαρόζης ψυγίσει σε περίπου 50C, προστίθενται 5 M L βρομιδίου αιθυδίου και η τελική συγκέντρωση βρομιδίου αιθυδίου είναι 1,0 m g/m L. Μετά τη ανάμειξη,χύνετε το διάλυμα αγαρόζης στην πλάκα ηλεκτροφορέσεως και το κρατάτε ακίνητο χωρίς να το μετακινείτε.

4) Αφού το τζελ έχει στερεώσει πλήρως (30-45 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου), αφαιρέστε απαλά τη χτένα, αφαιρέστε την ταινία και τοποθετήστε το τζελ στην συσκευή ηλεκτροφόρησης.

5) Στη διαδικασία ηλεκτροφορέσεως, προστέθηκε διάλυμα ηλεκτροφορέσεως (1'TAE) για να καλύψει την επιφάνεια του τζελ αγαρόζης με διάλυμα ηλεκτροφορέσεως περίπου 1-2 mm.