Πιθανή παρεμβολή και στρατηγικές αντιμετώπισης του HEPES στην ανάπτυξη του χρώματος του δείκτη φαινολικού κόκκινου

Σε κυτταρικές καλλιέργειες και βιολογικά πειράματα,Ταμείο ασφαλείας HEPESΤο πρώτο χρησιμοποιείται για τη διατήρηση της σταθερότητας του pH στο περιβάλλον καλλιέργειας, ενώ το δεύτερο χρησιμοποιείται για την οπτική απεικόνιση των αλλαγών του pH.Η αλληλεπίδραση μεταξύ των δύο από άποψη χημικών ιδιοτήτων μπορεί να οδηγήσει σε ανωμαλίες χρώματοςΑυτό το άρθρο θα αναλύσει τις αιτίες αυτού του φαινομένου και θα παρέχει απλοποιημένες λύσεις βελτιστοποίησης.

Χημική βάση της χρωματικής παρεμβολής

Το κόκκινο φαινόλης είναι ένα χρωστικό ευαίσθητο στο pH που αλλάζει χρώμα με την οξύτητα ή την αλκαλικότητα: εμφανίζεται κίτρινο σε όξινα περιβάλλοντα (pH < 6,8), κόκκινο σε ουδέτερα περιβάλλοντα (pH ≈ 7,4),και μοβ κόκκινο σε αλκαλικά περιβάλλοντα (pH> 8.2) Αυτό το χαρακτηριστικό το καθιστά ιδανικό εργαλείο για την παρακολούθηση του pH των μέσων κυτταρικής καλλιέργειας.

Η βασική λειτουργία του HEPES ως απόσβεσης είναι η σταθεροποίηση του pH με απελευθέρωση ή απορρόφηση ιόντων υδρογόνου.Το πρόβλημα είναι ότι οι ομάδες σουλφονικού οξέος στα μόρια HEPES έχουν μια παρόμοια χημική δομή με το φαινόλιο, και όταν η συγκέντρωση του HEPES είναι υψηλή, θα αλληλεπιδρούν με το φαινόλιο κόκκινο για να αλλάξουν τη μοριακή δομή του.Αυτή η αλλαγή προκαλεί το χρώμα του φαινολικού κόκκινου να γίνει πιο ανοιχτό ή να μετατοπιστεί σε ένα συγκεκριμένο pH, για παράδειγμα, μπορεί να εμφανιστεί πορτοκαλί κόκκινο αντί για το τυποποιημένο κόκκινο σε pH 7.4.

Η διαισθητική εκδήλωση του φαινομένου της παρεμβολής

Σε συμβατική κυτταρική καλλιέργεια, εάν χρησιμοποιούνται ταυτόχρονα υψηλές συγκεντρώσεις HEPES (όπως πάνω από 20 mmol/L) και φαινολικό κόκκινο, το χρώμα του μέσου καλλιέργειας μπορεί να είναι πιο ανοιχτό ή κίτρινο από ό, τι αναμενόταν..Για παράδειγμα, το μέσο καλλιέργειας pH 7,4, το οποίο θα έπρεπε να εμφανίζεται κόκκινο, μπορεί να έχει γίνει ανοιχτό πορτοκαλί λόγω της παρέμβασης του HEPES, οδηγώντας τους ερευνητές να καταλήξουν σε λανθασμένη εκτίμηση της τιμής pH.

Το φαινόλιο κόκκινο εκπέμπει φθορά σε συγκεκριμένα μήκη κύματος, ενώ το HEPES μπορεί να απορροφήσει μέρος του σήματος φθοράς,με αποτέλεσμα μείωση της φωτεινότητας της εικόνας ή αύξηση του θορύβου φόντουΤο φαινόμενο αυτό είναι ιδιαίτερα εμφανές σε μακροπρόθεσμες παρατηρήσεις ή σε πειράματα απεικόνισης ζωντανών κυττάρων, τα οποία μπορεί να καλύπτουν την πραγματική κατάσταση των κυττάρων.

Απλοποιημένο σχέδιο βελτιστοποίησης

Προσαρμόστε τη συγκέντρωση HEPES

1Η συμβατική καλλιέργεια: Ελέγξτε τη συγκέντρωση του HEPES εντός 10-15 mmol/L, η οποία έχει ελάχιστη παρεμβολή στην ανάπτυξη του χρώματος του φαινολικού κόκκινου και μπορεί να διατηρήσει αποτελεσματικά τη σταθερότητα του pH.

2- Σύντομο πείραμα: Εάν ο πειραματικός χρόνος είναι σύντομος (π.χ. < 4 ώρες), η συγκέντρωση του HEPES μπορεί να μειωθεί περαιτέρω σε 5 mmol/l ή να προστεθεί μόνο όταν είναι απαραίτητο.

3. Ευαίσθητα κύτταρα: Για κύτταρα που είναι εξαιρετικά ευαίσθητα στις αλλαγές του pH (όπως οι νευρώνες), συνιστάται να χρησιμοποιείται σύστημα αποθήκευσης με βυθιοκαρβονικό αντί του HEPES ή να αφαιρείται πλήρως το φαινόλιο κόκκινο.

Εναλλακτικές μεθόδους απεικόνισης χρωμάτων

1. Φαινόλιο κόκκινο ελεύθερο μέσο καλλιέργειας: Για πειράματα που απαιτούν υψηλές συγκεντρώσεις HEPES, μπορεί να επιλεγεί ένα μέσο καλλιέργειας χωρίς φαινόλιο κόκκινο,για την παρακολούθηση της οξύτητας και της αλκαλικότητας μπορούν να χρησιμοποιούνται λωρίδες δοκιμής pH ή ηλεκτρονικά μετρητές pH.

2. Φθοριούχοι ανιχνευτές: Χρησιμοποιώντας φθοριούχες χρωστικές ουσίες όπως BCECF-AM αντί του φαινολικού κόκκινου, αυτοί οι ανιχνευτές δεν επηρεάζονται από την παρέμβαση HEPES και μπορούν να παρέχουν πιο ακριβείς μετρήσεις pH.

3Διορθώσεως χρώματος: Εάν πρέπει να χρησιμοποιούνται ταυτόχρονα το HEPES και το φαινολικό κόκκινο, μπορεί να προετοιμαστεί εκ των προτέρων μια τυποποιημένη καμπύλη για τη διόρθωση της παρατηρούμενης απόκλισης χρώματος με τη χρωματιστομετρική μέθοδο.

Οπτικοποίηση πειραματικού σχεδιασμού

1. Σταδιακή αποθήκευση: Χρησιμοποιήστε το HEPES για τη διατήρηση του pH κατά τη διάρκεια του σταδίου προ-καλλιέργειας των κυττάρων και μεταβείτε σε ένα μέσο καλλιέργειας χωρίς HEPES πριν από την απεικόνιση για να μειώσετε τις παρεμβολές.

2Επιλογή μήκους κύματος: Στην απεικόνιση με φθορισμό,Αποφύγετε το κύριο μήκος κύματος απορρόφησης του κόκκινου φαινόλης (όπως 560nm) και επιλέξτε ένα κανάλι φθορισμού μεγαλύτερου μήκους κύματος (όπως 633nm) για τη μείωση των παρεμβολών φόντου.

3Ορισμός ελέγχου: Για κάθε πείραμα δημιουργήθηκε μια ομάδα ελέγχου χωρίς HEPES για την οπτική σύγκριση των διαφορών χρώματος.

Με την κατανόηση του μηχανισμού αλληλεπίδρασης μεταξύ HEPES και φαινόλης κόκκινο,Οι ερευνητές μπορούν εύκολα να προσαρμόσουν τις πειραματικές συνθήκες για να εξασφαλίσουν την αξιοπιστία των αποτελεσμάτων ανάπτυξης χρώματος, διατηρώντας παράλληλα τη σταθερότητα του συστήματος καλλιέργειαςΓια περίπλοκα πειράματα, συνιστάται να διεξάγονται πρώτα μικρής κλίμακας προκαταρκτικά πειράματα για την επαλήθευση της αποτελεσματικότητας του σχεδίου βελτιστοποίησης.

Η Hubei Xindesheng Material Technology ειδικεύεται στην παραγωγή HEPES και άλλωνβιολογικά αποθηκευτικά παράγοντεςΤα προϊόντα έχουν υψηλή καθαρότητα, καλή ικανότητα αποθήκευσης και προσιτές τιμές, παρέχοντας υποστήριξη για σχετικά πειράματα.Παρακαλώ, μη διστάσετε να επικοινωνήσετε μαζί μου.!